Práctica No. 3

Técnicas de desinfección y esterilización de materiales y medios de cultivo.

OBJETO DE APRENDIZAJE.

Aplicar los métodos de esterilización.

Competencia:

·         Conocer los principios generales de las técnicas de la esterilización de materiales de vidrio.

·         Identificar las partes de la estufa, autoclave u olla de presión y su funcionamiento.

·         Aplicar el método de esterilización por vía seca.

·         Aplicar el método de esterilización por vía húmeda.

·         Identificar medios de cultivo , clasificación y sus características

·         Reconocer la importancia de la esterilización en medios de cultivo

FUNDAMENTO:

Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía. Esta definición excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo.

 La palabra desinfección se aplica a la remoción o destrucción por cualquier vía de organismos vivos que pueden causar daño particular o infección. No significa por lo tanto la destrucción de todos los microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado.

Agente Antimicrobiano: El término de agente antimicrobiano se refiere a un agente que interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microbios. En el uso común, el término denota inhibición de crecimiento y cuando se refiere a grupos específicos de organismos, suelen usarse con frecuencia los términos tales como antibacterianos o anti fúngicos. Algunos agentes antimicrobianos se utilizan específicamente para el tratamiento de infecciones, estos se denominan agentes terapéuticos.

Un agente físico es una propiedad o condición que causa un cambio, por ejemplo; la temperatura, la presión, radiación y los filtros.

Un agente químico es una sustancia que causa una reacción específica y que se caracterizan por una estructura molecular típica, por ejemplo tenemos los compuestos fenólicos, los alcoholes, halógenos (cloro y yodo), aldehídos, oxido de etilo, fenoles.

Un proceso físico es un procedimiento que causa un cambio, por ejemplo; la filtración la esterilización, incineración, higienización. Se utilizan varios términos específicos para escribir a estos agentes y procesos:

Desinfectante: Un agente, usualmente un producto químico que mata las células vegetativas pero no necesariamente las formas esporuladas de los microorganismos productores de enfermedades, se denomina un desinfectante. El término se aplica comúnmente a sustancias usadas sobre objetos inanimados. La desinfección es el proceso mediante el cual se destruyen las células vegetativas pero no necesariamente las esporas de los agentes infecciosos.

Un antiséptico es un desinfectante, o sea un agente químico usado para destruir microorganismos dañinos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.

 Asepsia es la exclusión continuada de microorganismos contaminantes. Así por ejemplo el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo asépticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones asépticas.

Pasteurización es el término aplicado al proceso que se utiliza para la destrucción de algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y después enfriarla lo más rápidamente posible. Esta técnica no es de ninguna manera un procedimiento de esterilización. Es solamente un método para destruir organismos patógenos y al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos organismos que más pueden deteriorar la leche.

La razón fundamental para efectuar la esterilización en Microbiología Industrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos específicos.

Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:

1. Por destrucción total de microorganismos;
2. Por muerte o inactivación; y
3. Por eliminación con medios físicos.

I. Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un asa de platino o las bocas de tubo de ensayo o Erlenmeyer. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.

II. La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación.

En el caso de las autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmósferas. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor saturado bajo presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre también en el caso de los autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Después de la esterilización se mantienen las condiciones asépticas, haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.

III. La eliminación por medios físicos está restringida a la esterilización de gases líquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.

Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los microorganismos no es posible.

Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio y esteres de celulosa, siendo las fibras de un diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.

Esterilización por vía seca (calor seco)

El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

Estufas presentan doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.

Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito eléctrico.

Ventajas del calor seco:

v  No es corrosivo para metales e instrumentos.

v  Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas:

v  Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

Esterilización por vía Húmeda.

El efecto que causa este calor es matar al microorganismo por la coagulación de sus proteínas cuando se encuentran en una zona atmósfera húmeda y sometidos a altas temperaturas, además, es mucho más rápido y efectivo en su acción.

La acción letal del vapor proviene del calor latente liberado cuando se condensa en una superficie fría aumentando de esta manera la temperatura de la zona enfriada. La destrucción de las esporas bacterianas sigue un comportamiento de forma similar en tanto que el vapor se condensa en la pared de la espora y aumenta su contenido en agua que finalmente hidroliza y degrada el contenido proteico.

Este calor se aplica en forma de vapor de agua y a temperaturas mayores o menores de 100ºC combinadas con un aumento de la presión en algunos casos.

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones:

*El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua. 

*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Autoclave
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar)y se deja el material durante 20 a 30 minutos. El equipo, consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica, esta se cierra en la parte superior por una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento:
Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla de metal. Se cierra asegurando la tapa, sin ajustar los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

Tyndalización
Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio de la autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º se ocupará para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

Ventajas del calor húmedo:

v  Rápido calentamiento y penetración

v  Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo

v  No deja residuos tóxicos

v  Hay un bajo deterioro del material expuesto

v  Económico

Desventajas:

v  No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

v  Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.